Dilution atau pengenceran dilakukan dalam 2 tahap. Tahap pertama meliputi predilution, atau setiap bagian semen segar (yang baru dikoleksi) dengan 3 atau 4 bagian pengencer A yang hangat (yang sudah ditaruh di waterbath 35oC). Pengencer yang akan digunakan untuk predilution sebaiknya tidak mengandung glycerol, dan tetap disimpan pada waterbath, 35 derajat C untuk mempertahankan temperature semen. Pengencer yang digunakan memberikan lecityhin dan lipoproteins untuk melindungi spermatozoa dari coldshock (kejutan dingin) dalam proses pendinginan.
Penambahan antibiotika kedalam pengencer itu sangat diperlukan agar antibiotik bekerja/melawan mikroorganisme yang ada. Antibiotika pada prediluter nampaknya cukup baik dalam waktu selama 2 jam.
Biasanya pengoleksian semen dilakukan dua ejakulasi dari setiap pejantan setiap pengoleksian. Ada juga peternak yang mengoleksi hingga 3 kali ejakulasi pada setiap pengoleksian (Pada pejantan yang baik, yang masih bisa menaiki betina). Dalam hal ini ejakulasi pertama secara bertahap ditambah pengencer ( partially prediluted) dan disimpan dalam waterbath 35 derajat C hingga ejakulasi berikutnya siap untuk predilution. Semua ejakulasi kemudian dicampurkan. Ada juga pemroses yang lain menunggu 1 jam atau 2 jam hingga semen terkoleksi semua, baru ditambahkan pengencer. Tingkat pengenceran yang optimum akan tergantung dari total volume ejakulasi, konsentrasi dan motilitas.
2) Derajat pengenceran
Tujuan utama dari dilution rate yaitu memberikan jumlah spermatozoa motile yang optimum per breeding unit yang tersedia pada waktu inseminasi. Umumnya 10 sampai 20 juta sperma motile pada waktu inseminasi akan menghasilkan angka kebuntingan yang optimal. Bila semen cair digunakan pertama perlu diketahui initial motility (motilitas awal) nya dan konsentrasi sperma nya. Jumlah breeding unit ditentukan dengan membagi jumlah total sperma motile dengan 10 juta –20 juta. Derajat Pengenceran yaitu membandingkan jumlah ternak betinayang akan dikawin dalam satuan volume dosis dengan total volume ejakulasi.
Contoh perhitungan:
1. Untuk semen cair:
Diketahui : Volume ejakulasi : 5 ml
Motilitas : 70 persen
Konsentrasi : 1.000.000.000 per ml
Jumlah sperma motil yang diinginkan : 20.000.000/ ml)
Ditanyakan :
1. Jumlah ternak sapi betina yang dapat dikawin.
2. Derajat pengenceran.
3. Jumlah Pengencer yang harus ditambahkan.
Penyelesaian / Perhitungan :
1. Jumlah ternak betina yang akan dikawin/IB :
Volume x Motilitas x Konsentrasi
Jumlah sperma motile yang diinginkan
5 x 0.70 x 1.000.000.000
20.000.000
= 175
2. Derajat Pengenceran :
Jumlah ternak betina yang akan dikawin x 1ml dosis
Volume ejakulasi
= 175/5
= 35
3. Jumlah pengencer yang harus ditambahkan :
175 ml –5 ml vol. Semen = 170 ml.
Tambahkan sisa extender ke semen yang telah diencerkan tadi.
Catatan : Pengenceran akhir akan dilakukan apabila semen tersebut masih memiliki kualitas yang masih tetap baik pada pemeriksaan initial motility(Harus diperiksa dulu, dibawah mikroskop).