a) mempersiapkan alat untuk praktikum;
b) membersihkan alat dan sekaligus mensterilkannya dengan menggunakan alkohol 96 %,
c) mengeringkan alat tersebut di dalam inkubator selama sekitar satu jam;
d) mempersiapkan mikroskop;
e) mempersiapkan zat untuk pemeriksaan mikroskopik; dan
f) melakukan pemeriksaan mikroskopik setelah evaluasi makroskopik.
Tahapan evaluasi semen secara mikroskopik meliputi :
a) Motilitas Progresif Spermatozoa
Pengamatan motilitas progresif spermatozoa sekaligus dapat mengevaluasi gerak massa dan gerak individu spermatozoa. Alat yang digunakan untuk mengevaluasi motilitas adalah: mikroskop; contoh semen; gelas pengaduk; alkohol 70 –90 %; gelas objek (object glass); gelas penutup (cover glass); kertas pengering (tissue); dan kapas.
 |
| Gambar 37. Evaluasi semen secara mikroskopik |
Teknik pelaksanaan evaluasi mikroskopik untuk motilitas spermatozoa adalah sebagai berikut :
1) bersihkan gelas objek dengan kapas yang telah diberi alkohol, sehingga bebas kotoran dan lemak;
2) masukkan alat-alat ke dalam inkubator;
3) keluarkan alat (gelas objek) dan lap kembali dengan kertas tissue;
4) kocok tabung hingga semen homogen;
5) ambil setetes semen letakkan di atas gelas objek dan tutup dengan gelas penutup;
6) letakkan gelas objek di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 10 menggunakan cahaya redup
 |
| Gambar 38. Evaluasi gerak massa spermatozoa |
(1) Evaluasi Gerak Massa
Kriteria penilaian untuk gerak massa spermatozoa adalah sebagai berikut :
(a) tampak di bawah mikroskop gerakan gelombang besar, banyak, gelap, tebal, dan aktif seperti gumpalan awan hitam mendekati waktu hujan, dan cepat berpindah-pindah. Kondisi tersebut berarti menunjukkan motilitas spermatozoa sangat baik atau baik sekali (diberi tanda +++);
(b) tampak gerakan gelombang kecil, tipis, jarang, kurang jelas, dan lamban. Evaluasii gerakan tersebut adalah baik (diberi tanda ++);
(c) gerakan yang tampak kurang baik, tidak terlihat gerakan gelombang, melainkan hanya gerakan individu spermatozoa dan tidak progresif. Evaluasi motilitas adalah cukup (diberi tanda +);
(d) tampak di bawah mikroskop gerakan spermatozoa hanya sedikit, tidak ada gereakan individu sama sekali. Evaluasi motilitas adalah buruk (diberi tanda N = necrospermia)
(2) Evaluasi Gerak Individu
Kriteria penilaian untuk gerak individu spermatozoa adalah sebagai berikut :
(a) tampak gerakan spermatozoa progresif maju ke depan (diberi tanda p= progresif);
(b) tampak gerakan spermatozoa mundur (diberi tanda r = reserve);
(c) tampak gerakan spermatozoa bergetar (diberi tanda v = vibratory); dan
(d) tampak gerakan spermatozoa berputar (diberi tanda s = sirkuler).
(3) Evaluasi Motilitas Lainnya
Kriteria penilaian untuk motilitas lainnya adalah sebagai berikut :
(a) tidak ada gerakan spermatozoa atau immotil (diberi angka evaluasi 0);
(b) gerakan spermatozoa berputar di tempat (diberi angka evaluasi 1);
(c) gerakan spermatozoa berayun atau melingkar; kurang dari 50 % spermatozoa bergerak progresif, dan tidak ada gerakan gelombang (diberi angka evaluasi 2);
(d) sebanyak 50 –80 % spermatozoa bergerak progresif, dan terdapatgerakan massa spermatozoa (diberi angka evaluasi 3);
(e) sebanyak 90 % spermatozoa bergerak motil progresif, membentuk gerakan gelombang (diberi angka evaluasi 4); dan
(f) gerakan spermatozoa progresif, gerakan gelombang sangat cepat, dan diperkirakan sebanyak 100 % motil aktif (diberi angka evaluasi 5). Untuk dapat diproses lebih lanjut, maka angka motilitas spermatozoa minimal sebanyak 50 –80 % (atau angka evaluasi 3). Semakin tinggi angka evaluasi, maka semakin baik kualitas spermatozoa yang akan digunakan.
b) Persentase Spermatozoa Hidup
Evaluasi spermatozoa hidup dan spermatozoa mati menggunakan zat warna eosin atau eosin negrosin. Dasar acuan yang digunakan adalah sel yang telah mati daya permeabilitasnya meningkat sehingga daya serap terhadap zat warna tertentu meningkat pula. Spermatozoa yang mati akan menyerap zat warna eosin sehingga warnanya merah, sedangkan spermatozoa yang hidup tidak menyerap warna (Gambar 39).
 |
| Gambar 39. Persiapan evaluasi hidup mati spermatozoa |
Alat yang digunakan untuk evaluasi hidup mati spermatozoa adalah sebagai berikut :
1) gelas objek;
2) pipet;
3) NaCl 3 %;
4) NaCl fisiologis (9%);
5) zat warna eosin atau eosin negrosin;
6) batang gelas pengaduk;
7) lampu Bunsen; dan
8) mikroskop.
Teknik pelaksanaan evaluasi hidup mati spermatozoa adalah sebagai berikut :
1) panaskan sebanyak 4 buah gelas objek pada suhu 37 deratjatC
2) zat warna dipanaskan sehingga mencapai suhu 37 derajat C
3) teteskan zat warna pada bagian pinggir salah satu gelas objek;
4) goyang-goyang semen hingga homogen, kemudian ambil contoh semen menggunakan batang gelas, teteskan semen ke gelas obyek, lalu campurkan secara merata dengan zat warna;
5) ambil gelas objek yang lain, tempelkan bagian ujungnya pada semen yang telah bercampur zat warna;
6) letakkan ujung gelas objek yang telah terkena semen dengan posisi miring sekitar 30 derajatpada gelas objek yang lain;
7) usapkan semen tersebut segera tipis-tipis, kemudian diangin-anginkan atau dipanaskan di atas api Bunsen;
8) setelah kering sediaan (preparat) diamati di bawah mikroskop perbesaran 45 x 10 atau 100 x 10 (menggunakan minyak emersi);
9) hitung spermatozoa yang berwarna merah dan yang tidak berwarna sebanyak 200 ekor;
10) lakukan penghitungan 3 kali pada bidang pandang yang lain (hasilnya dirata-rata); dan
11) persentase spermatozoa hidup adalah jumlah spermatozoa yang mati (warna merah) dibagi total spermatozoa yang diamati kali 100 persen
c) Persentase Spermatozoa Abnormal
Evaluasi abnormalitas spermatozoa dibagi dalam dua kelompok, yaitu :
1) abnormalitas primer dan
2) abnormalitas sekunder.
Spermatozoa yang masuk kategori abnormalitas primer adalah kelainan yang terjadi sejak pembentukan spermatozoa di dalam organ kelamin primer (testis) dalam proses spermatogenesis. Abnormalitas sekunder adalah kelainan spermatozoa yang terjadi akibat tekanan fisik untuk evaluasi semen, misalnya akibat mengocok tabung terlalu keras, penurunan suhu terlalu cepat, suhu pemanasan yang terlalu tinggi, dan atau saat pembuatan sediaan (preparat) yang tidak hati-hati.
 |
| Gambar 40. Aneka bentuk abnormalitas spermatozoa |
Abnormalitas primer ditandai dengan adanya beberapa kelainan, seperti kepala kecil, kepala besar, bentuk kepala kerucut, kepala miring, kepala dua, kepala bulat, ekor dua, akrosoma salah bentuk, dan leher besar. Abnormalitas sekunder ditandai dengan adanya kelainan seperti kepala terlepas, leher patah, ekor patah, dan ekor bergelung (Gambar 40).
Alat yang digunakan untuk sediaan evaluasi persentase spermatozoa hidup dapat juga digunakan untuk evaluasi abnormalitas spermatozoa, dan mikroskop.
Teknik pelaksanaan evaluasi adalah sebagai berikut :
1) letakkan sediaan di bawah mikroskop dengan perbesaran 45 x 10;
2) amati dan hitung spermatozoa yang normal dan abnormal primer minimal sebanyak 200 sel;
3) apabila dari hasil evaluasi jumlah spermatozoa abnormal primrer ≥ 20 %, berarti kualitas spermatozoanya jelek;
4) bila dari hasil evaluasi jumlah spermatozoa abnormal sekunder ≥ 25 %, maka pembuatan sediaan harus diulang;
5) bila total spermatozoa abnormal baik primer maupun sekunder = 20 %, maka kualitas spermatozoanya masih termasuk kategori normal untuk digunakan
d) Konsentrasi Spermatozoa
Konsentrasi spermatozoa adalah salah satu evaluasi untuk mengetahui jumlah total spermatozoa per ml cairan semen. Meskipun evaluasi perhitungan konsentrasi bersifat pendugaan, namun validitas angkanya terjamin.
Evaluasi konsentrasi ada 2 cara, yaitu :
1) pendugaan berdasarkan jarak antar kepala spermatozoa, dan
2) menggunakan bilik hitung Neubauer atau Thoma (Gambar 41).
1) Pendugaan konsentrasi berdasarkan jarak antar kepala.
Alat yang digunakan adalah mikroskop; gelas objek; gelas penutup; dan contoh semen.
 |
| Gambar 41. Penetesan semen ke bilik hitung Neubauer (Thoma) untuk mengevaluasi konsentrasi spermatozoa |
Teknik pelaksanaannya adalah sebagai berikut :
(a) teteskan sedikit contoh semen ke atas gelas objek;
(b) tutup tetes semen dengan gelas penutup;
(c) letakkan sediaan di bawah mikroskop perbesaran 45 x 10;
(d) amati jarak antara kepala spermatozoa,
Hasil evaluasinya adalah sebagai berikut :
(a) Densum(D) atau padat, jika jarak antara dua kepala spermatozoa kurang dari panjang satu kepala spermatozoa; dugaan konsentrasinya adalah sekitar 1.000 sampai 2.000 juta spermatozoa per ml semen.
(b) Semidensum (SD) atau sedang, bila jarak antar kepala spermatozoa panjangnya 1 sampai 1½ kepala spermatozoa; dugaan konsentrasinya adalah 500 sampai 1.000 juta spermatozoa per ml semen.
(c) Rarum (R) atau jarang, jika jarak antara kepala spermatozoa melebihi 1½ hingga seluruh panjang spermatozoa; dugaan konsentrasinya sekitar 200 sampai 500 juta spermatozoa per ml semen.
(d) Oligospermia (OS) atau sedikit, bila jaraknya lebih dari seluruh panjang spermatozoa; dugaan konsentrasinya sekitar 200 juta spermatozoa per ml semen.
(e) Aspermia (A) atau tidak ada spermatozoa, bila dari pengamatan tidak ada sama sekali spermatozoa dari contoh sediaan.
2) Evaluasi konsentrasi menggunakan bilik hitung Neubauer (Thoma)
Alat yang digunakan adalah mikroskop; bilik hitung Neubauer (Thoma); gelas penutup; methylen blue; NaCl 3%; pipet eritrosit (erythrocyt pipette); contoh semen; dan kertas pengering (tissue) Teknik pelaksanaannya adalah sebagai berikut :
(a) Siapkan bilik hitung Neubauer di bawah mikroskop perbesaran 45 x 10, tepatkan kotak kecil Neubauer di bawah bidang pandang (Gambar 42);
(b) Hisap semen menggunakan pipet eritrosit hingga angka 0.5;
(c) Kemudian hisap larutan NaCl 3% hingga angka 101 (NaCl 3% sebagai pengencer semen sekaligus pembunuh spermatozoa);
(d) Kocok pipet dengan membentuk angka 8 selama 2 sampai 3 menit secara hati-hati dan cepat;
(e) Buang 2 sampai 3 tetes semen dari dalam pipet, dan keringkan ujung pipet dengan tissue;
(f) Teteskan semen ke kotak Neubauer dan tutup dengan gelas penutup;
(g) Hitung total spermatozoa yang berada di dalam kotak menyilang dan kotak pojok dari 16 kotak kecil (Gambar 42);
(h) Ulangi penghitungan hingga 3 kali dari bidang pandang yang lain, rata-ratakan hasilnya;
(i ) Misalnya hasil pengamatan total spermatozoa adalah = X , maka konsentrasi spermatozoa adalah X x 10 pangkat 7/ml semen.
 |
| Gambar 42. Kotak-kotak kecil bilik hitung Neubauer |